ELISA實驗時需要注意避光反應主要是看顯色所用的底物，OPD的話要避光，因為這種底物受光照后會自行變色，如果用TMB底物的話，就沒這么嚴格了，其他的步驟中像抗原綁定、洗滌之類也都不用避光，只有在做完二抗洗滌完上酶顯色底物的時候，因為大部分的底物對光敏感的，見光會分解，所以要求避光操作。當顯色完成后（顯色時間是比較短的，需要預先摸索好）加入顯色終止液后溶液顏色會在幾個禮拜之內保持穩定，也不用再避光了。

其他反應步驟加蓋封板膜的作用不是避光，而是防止反應過程中有異物落入板孔，從而對檢測結果造成影響，同時加蓋封板膜還能減少液體的蒸發，保持反應體系的均衡，保證檢測結果的準確性。